天昊生物肿瘤内生菌绝对拷贝数检测，采用“16S qPCR绝对定量 + 16S rDNA扩增子测序”策略，可以根据qPCR绝对定量和16S rDNA扩增子相对定量测序结果，计算样品中微生物的绝对丰度。该技术将为肿瘤内生菌对肿瘤的发生发展及治疗预后效果等研究，提供了新的分析方法。

技术优势

1、qPCR绝对定量检测采用的是TaqMan探针法而不是常见的SYBR green方法，可以获得更高特异性结果。

2、qPCR绝对定量检测，采用细菌16S rDNA佳的通用引物。

3、本实验16S rDNA扩增子测序采用的是高特异性、高灵敏度的扩增体系，极大程度上降低了宿主的非特异性扩增。

4、目前我们的“天昊云”在线分析平台，已经上线配套的分析工具，便于项目客户对获得的qPCR绝对拷贝数和扩增子测序结果进行在线分析，真正实现了生信分析的自主高效。

样品类型：主要针对肿瘤组织及DNA进行检测，可以是常规的新鲜冷冻组织样本，也可以是石蜡样本（未经染色），以及完整无污染的基因组DNA

样品需求量：DNA≥50 ul（指按照DNA抽提试剂盒说明书要求的组织重量和洗脱体积进行抽提得到的DNA原液）（满足2次qPCR+测序实验）；常规的软组织样本（样本需求量>=200mg，绿豆大小），未经染色处理的石蜡保存类型的样本，送样量不低于5片（10um厚度，组织大小在1cm2）

送样方式：每个离心管用parafilm膜密封，冰袋运输

DNA提取建议：常规组织样本选择FastDNA^® Spin Kit for Soil（116560200，MP）进行DNA抽提，FFPE样本选择石蜡包埋组织 DNA 快速提取试剂盒（DP330，天根）进行DNA抽提

16S qPCR实验技术路线

16S rDNA扩增子测序及与qPCR绝对定量检测数据的联合分析（天昊云）

1、16S TaqMan qPCR部分：

提供qPCR原始数据，以及导出的Ct值数据，结果达到：

a. 标准曲线梯度：拟合系数：R2 ≥ 0.99；

b. 3技术重复CV% < 5%（Ct < 30）。

2、16S扩增子测序部分：

提供PE250的fastq数据，以及相对定量测序分析内容，结果达到：

a.     总数据量 ≥ 5万reads；

b.    Clean data Q30 ≥ 80%。

1. Fu A, Yao B, Dong T, et al. Tumor-resident intracellular microbiota promotes metastatic colonization in breast cancer. Cell, 2022, 185(8): 1356-1372. e26.

2. Yao B, Dong T, Fu A, et al. Quantification and characterization of mouse and human tissue-resident microbiota by qPCR and 16S sequencing. STAR protocols, 2022, 3(4): 101765.

1、样本DNA浓度偏低，Qubit检测无浓度值的样本是否能进行内生菌绝对拷贝数检测？

答：样本总DNA浓度无法代表目标基因的模板量，无法根据DNA的浓度来估算16S rRNA基因的拷贝数，建议进行16S rRNA基因Taqman qPCR检测的预实验，根据预实验结果来决定样本是否继续进行正式检测。

其中针对低质量的石蜡肿瘤组织样本，由于样本本身保存方式造成的核酸降解、突变等情况，可能会造成检测结果拷贝数偏低，甚至出现假阴性结果的风险。

2、样本同时进行16S TaqMan qPCR绝对拷贝数检测和16S扩增子测序，如何进行联合分析，得到微生物在绝对拷贝数水平上的群落结构差异？

答：登录公司网站www.geneskybiotech.com，进入天昊云平台，选择“微生物qPCR绝对定量”项目，按照提示输入数据，运行程序，即可得到微生物在绝对拷贝数水平上的群落结构差异结果。详细可咨询生物信息部。

3、16SV4区域扩增子测序结果中是否有高比例的宿主序列存在？

答：实验采用的是高特异性、高灵敏度的扩增体系，极大程度上降低了宿主的非特异性扩增。目前测试项目16S的扩增子测序结果中（人，小鼠），几乎没有宿主序列的占比。